IT4IP核孔膜在诱导脂质囊泡膜融合和细胞内递送的应用研究

高分子聚合物薄膜经高能重离子辐照后，在薄膜中沿入射离子路径上会形成圆柱状损伤区域，直径约１０ｎｍ，这些损伤区域称作离子的潜径迹，潜径迹经过化学蚀刻处理可形成中空通道（孔），即为核孔膜。相比于常规滤膜，IT4IP核孔膜拥有众多优点，如表面平整光滑、孔径均一、圆柱形孔形（图１－１），此外还具有机械强度高、过滤速度快和截留特性好等优点。

IT4IP核孔膜的生产工艺主要包括辐照、紫外敏化和蚀刻等三个主要步骤。辐照一般利用加速器或者反应堆进行，目前主要都采用加速器进行辐照。紫外敏化主要是改善核孔膜的孔形，让锥度更小、透气率更高、孔径更均匀。化学蚀刻则决定核孔膜最终孔径大小

基于IT4IP核孔膜的特点，其应用已相当广泛。目前，很多微生物检测、癌细胞的检测以及气体的检测都需要用到核孔膜截留取样。在制药工业，核孔膜主要用于药用水的过滤及终端除菌过滤，血液制品的过滤，空气与蒸汽的过滤等。在食品饮料行业，核孔膜用于酒类、饮用水、奶制品、茶饮料等的澄清和除菌过滤，可代替离心法用于分离，或代替热处理法用于除菌。在电子工业，可用于制备光刻胶及环境气体净化，以提高电子产品的质量和成品率。在化工业，IT4IP核孔膜用于制备超纯试剂及溶剂中贵重的悬浮物和触媒的回收等。此外，在药用及化妆品用脂质体制剂的研发和生产中，基于核孔膜的挤出法是脂质体粒径均一化及降低粒径的常用方法之一。

本文基于IT4IP核孔膜的挤出法进行了两部分研宄，一是挤出法诱导脂质囊泡膜融合并构建杂化外泌体，二是基于挤出法的细胞内递送研究。主要内容及结果如下：

１、挤出法诱导荧光标记脂质体与空白脂质体发生膜融合。采用荧光共振能量转移法对膜融合过程进行了定性和定量分析，并检测了膜融合前后脂质体粒径的变化，以冻融法作为对照。结果显示，经过挤出处理，焚光标记脂质体和空白脂质体发生了膜融合，也即荧光标记磷脂转移到空白脂质体，膜融合效率与冻融法相当，且耗时较短。相比冻融法，所制得的膜融合脂质体粒径均一。

２、挤出法可诱导荧光标记脂质体和外泌体发生膜融合，即构建杂化外泌体。首先用透射电镜对从Ｋ５６２培养上清提取的外泌体进行了鉴定，然后利用挤出法诱导荧光标记脂质体与外泌体发生膜融合，荧光共振能量转移法对膜融合过程进行了定性和定量分析，并检测了膜融合前后脂质囊泡粒径的变化，以冻融法作为对照。结果显示，经过挤出处理，焚光标记脂质体和外泌体发生了膜融合，但透射电镜下杂化外泌体仍然保持了典型的茶托结构。挤出法的膜融合效率稍低于冻融法，但其具有耗时短的优点。此外，挤出法制备的杂化外泌体具有较均匀的粒径，而冻融法构建的杂化外泌体则粒径及粒径分布范围都变大。

３、基于IT4IP核孔膜的挤出法可通过诱导ＣＴ２６细胞变形及细胞膜短暂穿孔而将介质中各种大分子递送进入细胞，经挤出处理的ＣＴ２６细胞仍可正常贴壁生长及增殖。膜孔径和递送材料的分子量是影响递送效率的重要因素。不同分子量右旋糖酐经挤出递送后，在细胞浆和细胞核都有分布，但是质核比与分子量呈正相关。

４、基于IT4IP核孔膜的挤出法可通过诱导Ｋ５６２细胞变形及细胞膜短暂穿孔而将介质中各种大分子递送进入细胞，经挤出处理的Ｋ５６２细胞任可正常生长及增殖。膜孔径和递送材料分子量是影响递送效率的重要因素。此外，不同分子量的右旋糖酐经挤出递送后，在细胞浆和细胞核都有分布，水合半径大于核膜复合体被动扩散尺度上限的２ＭＤａ右旋糖酐主要在挤出处理后起初的１小时内进入细胞核，这强烈提示挤出处理诱导了核膜破裂，从而允许其进入细胞核。